摘要：目的通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得肌肉特異性表達(dá)Cas9蛋白小鼠胚胎,為建立肌肉特異表達(dá)Cas9小鼠動物模型奠定基礎(chǔ)。方法設(shè)計小鼠Rosa26位點sgRNA并通過體外酶切驗證活性,同時使用同源重組構(gòu)建肌肉特異性同源打靶載體;通過顯微注射將Rosa26sgRNA與Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通過PCR及測序檢測胚胎的編輯情況,同時移植到假孕母鼠體內(nèi),待其生產(chǎn);將同源打靶載體與Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通過PCR檢測整合情況。結(jié)果體外酶切實驗表明,體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA與Cas9蛋白聯(lián)合可對靶位點產(chǎn)生編輯作用;成功構(gòu)建了肌肉特異性同源打靶載體Donor-SP-px459;通過原核注射獲得Rosa26基因編輯胚胎,經(jīng)移植獲得Rosa26基因編輯小鼠;注射同源打靶載體后,成功獲得肌肉特異表達(dá)Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù),成功獲得Rosa26基因編輯胚胎和小鼠,并獲得了肌肉特異性表達(dá)Cas9蛋白小鼠胚胎,為利用基因打靶構(gòu)建肌肉特異表達(dá)Cas9的小鼠動物模型奠定基礎(chǔ)。