摘要：試驗旨在克隆并構建水牛miR-302s慢病毒真核表達載體(bbu-miR-302s),對其進行生物信息學分析,并嘗試將該載體應用于水牛體細胞重編程中。以水牛基因組DNA為模板擴增得到bbu-miR-302s前體序列,測序正確后將其連入pLVX-IRES-ZsGreen1構建重組慢病毒真核表達載體。重組的慢病毒真核表達載體經過酶切鑒定正確后,采用脂質體轉染方法包裝慢病毒顆粒,通過感染HEK-293T細胞及豬和水牛體細胞,檢測重組慢病毒載體的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎兒成纖維細胞(BFF)后,經誘導培養(yǎng),檢測能否產生水牛誘導多能干細胞(iPSC)。采用CoGeMiR數據庫查詢法和SnapGene Viewer軟件進行miR-302s家族在基因組中的定位分析;利用ClustalX 1.83軟件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk軟件預測bbu-miR-302s主要的靶基因,并運用DAVID程序對靶基因進行信號通路富集。測序結果顯示,擴增獲得的序列是水牛miR-302s家族,包裝的重組慢病毒滴度為7.2×10 6 TU/mL,并可以有效感染3個物種的體細胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,細胞經歷形態(tài)變化并發(fā)生聚集形成克隆樣,堿性磷酸酶檢測陽性,但多能基因及表面抗原檢測結果均為陰性,說明單因子miR-302s不足以完全重編程BFF為水牛iPSC,但促進了重編程進程。CoGeMiR數據庫檢索發(fā)現,miR-302s家族主要位于LARP 7基因的內含子區(qū);SnapGene Viewer軟件進一步分析發(fā)現,bbu-miR-302s位于水牛7號染色體LARP 7基因的內含子區(qū)。序列同源性分析表明,miR-302s家族成員間及miR-302s簇成員在不同物種間均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255個,這些靶基因主要集中在33個信號通路中,其中PGK信號通路與胰高血糖素信號轉導及調控干細胞信號通路最為顯著。本研究結果為后續(xù)開展miR-302s簇在體細胞重編程中的作用奠定基礎。