摘要：目的構(gòu)建高拷貝表達(dá)重組人組織因子途徑抑制因子的畢赤酵母并對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行初步優(yōu)化，為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。方法將PCR擴(kuò)增得到的TFPIcDN段與表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K連接構(gòu)建重組質(zhì)粒rhTFPI—pPIC9K，采用PCR方法及DNA測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GSI15，利用G418抗性實(shí)驗(yàn)篩選含有高拷貝TFPIcDNA的畢赤酵母菌株，采用WesternBlot和TFPI檢測(cè)試劑盒分析重組蛋白表達(dá)。通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及甲醇濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。結(jié)果PCR擴(kuò)增rhTFPI-pPIC9K得到預(yù)期的擴(kuò)增條帶（1．2kb），經(jīng)酶切圖譜分析及測(cè)序確認(rèn)成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒rhTFPI—pPIC9K。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，通過(guò)G418篩選獲得了含高拷貝基因的酵母細(xì)胞，WesternBlot結(jié)果顯示含基因拷貝數(shù)與蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，明顯提高了TFPI重組蛋白的表達(dá)量，重組TFPI表達(dá)量高達(dá)（9．95±0．78）mg／L，活性達(dá)到（3．91±1．37）U／mL。結(jié)論成功構(gòu)建了高效表達(dá)TFPI重組蛋白的畢赤酵母細(xì)胞株，為TFPI功能研究及在相關(guān)疾病防治中的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。